研究所研究費採択課題詳細 2006年度

α-トコフェロール輸送タンパク質(α-TTP)と相互作用する因子の解析

研究課題名 α-トコフェロール輸送タンパク質(α-TTP)と相互作用する因子の解析
研究所名 科学技術研究所
研究種別 重点研究
研究概要 (本年度の研究実施計画)
1)Yeast two-hybridシステムによるα-TTPと相互作用する因子のスクリーニング
 昨年に引き続き,Yeast two-hybrid screening用に調製された,ヒト脳,胎盤,子宮 cDNAライブラリーを用い,α-TTP全長をbaitとして常法に従ってスクリーニングを行う。酵母に導入されて発現したα-TTPとライブラリー由来の因子が相互作用すると,酵母の栄養欠乏培地への生育およびX-galの資化によるコロニーの青色化が生じる。これを指標として一次,二次スクリーニングを行い,α-TTPと相互作用する因子が導入されたコロニーを選択し,導入されたプラスミドに組み込まれたcDNAを取得する。
2)取得したタンパク質の同定
 得られたコロニーからライブラリー由来のcDNAを調整し,常法に従って塩基配列の解析を行う。ヒト由来のライブラリーを用いて実験を行うため,得られたcDNAの塩基配列とヒトゲノムデータベースとのホモロジー検索を行うことにより,cDNAから合成されるタンパク質の同定が可能となる。
3)取得したタンパク質とα-TTPのin vitroにおける相互作用の検討
 得られたcDNAをGST融合タンパク質発現ベクターに組み込んで大腸菌で大量発現させ,グルタチオンカラムを利用して精製する。一方,α-TTPとGFPの融合タンパク質発現ベクターを動物培養細胞に導入して発現させ,α-TTP-GFPを調製する。グルタチオンビーズを用いてGST融合タンパク質とα-TTP-GFPを共沈させた後,抗GFP抗体を用いたイムノブロッティングにより,共沈物中のα-TTP-GFP融合タンパク質を検出する。この検出により,取得したタンパク質とα-TTPのin vitroにおける結合活性があるかどうかを検討する(pull down assay)。
4)肝臓におけるα-TTP-タンパク質相互作用の解析
 先行してα-TTPと相互作用する肝臓中の因子が取得されているため,これらの因子とα-TTPの肝臓内での相互作用の確認,肝臓細胞内での局在の解析,結合部位の決定,結合部位を欠失させた際のα-トコフェロール輸送の検討を行う。
研究者 所属 氏名
  農学部 助教授 竹中麻子
研究期間 2005.4~2007.3
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