研究・知財戦略機構 学内フォーマット集
α-トコフェロール輸送タンパク質（α-TTP）と相互作用する因子の解析
| 研究課題名 | α-トコフェロール輸送タンパク質（α-ＴＴＰ）と相互作用する因子の解析 | ||
| 研究所名 | 科学技術研究所 | ||
| 研究種別 | 重点研究 | ||
| 研究概要 | （本年度の研究実施計画） 1）Yeast two-hybridシステムによるα-TTPと相互作用する因子のスクリーニング 昨年に引き続き，Yeast two-hybrid screening用に調製された，ヒト脳，胎盤，子宮 cDNAライブラリーを用い，α-TTP全長をbaitとして常法に従ってスクリーニングを行う。酵母に導入されて発現したα-TTPとライブラリー由来の因子が相互作用すると，酵母の栄養欠乏培地への生育およびX-galの資化によるコロニーの青色化が生じる。これを指標として一次，二次スクリーニングを行い，α-TTPと相互作用する因子が導入されたコロニーを選択し，導入されたプラスミドに組み込まれたcDNAを取得する。 2）取得したタンパク質の同定 得られたコロニーからライブラリー由来のcDNAを調整し，常法に従って塩基配列の解析を行う。ヒト由来のライブラリーを用いて実験を行うため，得られたcDNAの塩基配列とヒトゲノムデータベースとのホモロジー検索を行うことにより，cDNAから合成されるタンパク質の同定が可能となる。 3）取得したタンパク質とα-TTPのin vitroにおける相互作用の検討 得られたcDNAをGST融合タンパク質発現ベクターに組み込んで大腸菌で大量発現させ，グルタチオンカラムを利用して精製する。一方，α-TTPとGFPの融合タンパク質発現ベクターを動物培養細胞に導入して発現させ，α-TTP-GFPを調製する。グルタチオンビーズを用いてGST融合タンパク質とα-TTP-GFPを共沈させた後，抗GFP抗体を用いたイムノブロッティングにより，共沈物中のα-TTP-GFP融合タンパク質を検出する。この検出により，取得したタンパク質とα-TTPのin vitroにおける結合活性があるかどうかを検討する（pull down assay）。 4）肝臓におけるα-TTP-タンパク質相互作用の解析 先行してα-TTPと相互作用する肝臓中の因子が取得されているため，これらの因子とα-TTPの肝臓内での相互作用の確認，肝臓細胞内での局在の解析，結合部位の決定，結合部位を欠失させた際のα-トコフェロール輸送の検討を行う。 |
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| 研究者 | 所属 | 職 | 氏名 |
| 農学部 | 助教授 | 竹中麻子 | |
| 研究期間 | 2005.4～2007.3 | ||
| リンク | |||