複雑な遺伝子改変・導入手続きをワンステップで ~CRISPR/Cas9システムを使用した、効率的なゲノム編集法を開発~
2019年06月04日
明治大学
東京理科大学
明治大学
東京農工大学
研究の要旨とポイント
イネの病原菌であるイネいもち病菌をモデルに、CRISPR/Cas9システムを用いたゲノム編集を効率的に行う技術を開発しました。 遺伝子操作をより自由に、高効率で行えるため、イネいもち病菌の研究の進展や、糸状菌(かび)を利用した食物、発酵物、生物工場などへの応用も期待されています。 |
【研究の背景】
DNAの情報を何らかの方法で書き換えてしまえば、タンパク質を作れなくしたり、全く別のタンパク質を作らせたりして、生物の特徴を変えることができます。
CRISPR/Cas9システムでは、編集したいDNAの配列に合わせて人工的に設計したRNAと、DNAを切ることのできる酵素をセットで使用します。RNAが標的となる配列を識別して結合し、酵素が二本鎖の切断(Double-stranded break, DSB)をおこないます。
DNA中にはよく似た塩基配列も多数ありますが、RNAが標的塩基配列に正しく結合できるかどうかは、標的塩基配列の下流につづく、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)と呼ばれる特定の配列パターンの存在に依存しています。PAM配列があることで、RNAは標的の塩基配列とよく似た配列を避け、標的の配列だけに結合できるようになります。
CRISPR/Cas9を含めた多くのゲノム編集法では、DSBと、DSBが誘発する細胞の遺伝子修復メカニズムを利用しています。修復メカニズムの一つ、相同組換え反応(Homologous recombination, HR)では、切断部分と全く同じかよく似た塩基配列を鋳型として修復が行われます。
壊れたところをそれと全く同じかよく似たもので補う、と考えれば起きていることはシンプルですが、実際の機序は複雑で、修復の効率は生物種や、ゲノムの構造によって異なります。また、HR自体のプロセスにも『非交差(遺伝子変換)』型と『交差』型の二種類があります。非交差型は塩基配列をコピーすることによって、交差型では鋳型配列をコピーしたうえでDNA配列を入れ替えることによって修復が行われます。そのため、交差型のHRは、減数分裂を行う細胞、すなわち生殖細胞でよく起きることが知られています。
しかし、体細胞分裂中にどのような修復反応が起きているのかを観察した研究は少なく、イネいもち病菌のような糸状菌(かび)では、情報はほぼ皆無でした。
【研究の詳細】
研究グループは、単一交差型HRにより、ベクター全体がhphと共に標的部位に挿入されると推定しました。この操作による変異体は、ハイグロマイシンBへの耐性を持ち、メラニンを欠損するように設計されているため、ハイグロマイシンBを含む培地上で白色のコロニーとして同定されると期待されました。
以上の実験の結果、CRISPR/Cas9ベクターの導入によって、ハイグロマイシンBに耐性を持つ白色のコロニーの数が劇的に増加することが確認されました。このことは、CRISPR/Cas9システムが、単一の交差型HRの誘導に有効であるということを意味します。今回の手法の利点は、修復用の鋳型として準備する相同塩基配列が一つで済み、これまで困難であった自由な塩基配列の改変が可能なことです。また、およそ100塩基対程度の短い相同塩基配列でも可能です。
グループは更に、同様の手法を用いて、CRISPR/Cas9ベクターを用いた単一交差型のHRにより、新規の遺伝子配列を標的部分に導入(ノックイン)することが可能かどうかの確認を行いました。確認に使用したのは、緑色蛍光タンパク質(GFP)の遺伝子で、GFP遺伝子はゲノムに挿入されたとき、ゲノムを保有する宿主の細胞が緑色に輝くことから、挿入の成否を表す「レポーター」遺伝子として広く利用されています。SDH遺伝子の直下にGFPの導入を試みたところ、ハイグロマイシンB培地上に緑色蛍光を示すコロニーが発生し、開発した手法が効率的な「ワンステップ」での遺伝子ノックインに有効であることが確認できました。
今回の研究では、糸状菌を含む真菌のCRISPR/Cas9によるゲノム編集では、必ずしもPAM配列によって制約されない可能性も示唆されています。今回の成果について、研究チームは「糸状菌は固有のゲノム特性を持ち、生殖細胞だけでなく体細胞でも、標的DNAの切断により、交差型のHRが頻繁に誘導されるとわかりました。これらの特性を利用して、標的DNAの改変と、レポーター遺伝子のノックインを行いました。また、DSBからノックインまでの操作をワンステップで行えるようになったことで、ノックインの高効率化にも成功しました。CRISPR/Cas9システムでは、PAM配列が不在の場合に正確な二本鎖切断導入が困難になるという課題がありましたが、本手法を用いることで、これまでの糸状菌研究では難しかったより自由度の高いゲノム編集をPAM配列に依存せずに行うことができるようになります」と評価しています。
【今後の展望】
【論文情報】
論文タイトル:Single crossover-mediated targeted nucleotide substitution and knock-in strategies with CRISPR/Cas9 system in the rice blast fungus
DOI:https://doi.org/10.1038/s41598-019-43913-0
【発表者】
・ Misa Kuroki, Department of Applied Biological Science, Tokyo University of Science, Tokyo
・ Akihito Nozaka, Department of Applied Biological Science, Tokyo University of Science, Tokyo
・ Takashi Kamakura, Faculty of Agriculture, Tokyo University of Science, Tokyo
・ Ai Handa, Graduate School of Agriculture, Meiji University, Kanagawa
・ Tohru Yamato, Graduate School of Agriculture, Meiji University, Kanagawa
・ Shuichi Ohsato, Graduate School of Agriculture, Meiji University, Kanagawa
・ Shigeru Kuwata, Graduate School of Agriculture, Meiji University, Kanagawa
・ Tsutomu Arie, Faculty of Agriculture, Tokyo University of Agriculture and Technology, Tokyo
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