明治大学大学院農学研究科環境バイオテクノロジー研究室の伊東 昇紀助教、片山 徳賢(博士後期課程2年)、小山内 崇准教授らの研究グループは、光合成を行うバクテリアであるラン藻のクエン酸回路では、リンゴ酸がピルビン酸に変換されることを発見しました。
<研究成果のポイント>
- 一般的なクエン酸回路では、リンゴ酸脱水素酵素という酵素の働きによってリンゴ酸がオキサロ酢酸に変換されるが、ラン藻では、リンゴ酸脱水素酵素の活性が低く、リンゴ酸がどのように変換されているのか不明瞭であった。
- ラン藻は、リンゴ酸をピルビン酸に変換するマリックエンザイムという別のリンゴ酸変換酵素をもっているが、この酵素が、リンゴ酸脱水素酵素の代わりにクエン酸回路で働いているかはわかっていなかった。
- 本研究の解析によって、ラン藻のクエン酸回路では、マリックエンザイムによって、リンゴ酸が“ピルビン酸”に変換されることが判明した。
- 本研究成果は、これまで生物全体で広く保存されていると考えられてきたクエン酸回路の酵素(酵素反応)が、生物ごとに異なることを示唆しており、本研究で行ったような解析の必要性を示している。
要旨
クエン酸回路は、生命活動に必要なエネルギーやアミノ酸の生成に関わる代謝経路です。酸素発生型の光合成を行うバクテリアであるラン藻も、クエン酸回路をもっています。クエン酸回路は、8つの酵素反応によって構成されており、それらの酵素は生物全体で広く保存されています。一般的に、クエン酸回路において、リンゴ酸は、リンゴ酸脱水素酵素(MDH)によって、オキサロ酢酸に変換されます。しかしながら、以前の研究で、ラン藻のMDHの活性は、著しく低いことが判明しました。ラン藻は、リンゴ酸を変換する他の酵素として、リンゴ酸をピルビン酸に変換するマリックエンザイム(ME)という酵素をもっていますが、MEがMDHの代替として働くかは分かっていませんでした。
本研究グループは、ラン藻のMEとMDHに着目した解析を行い、どちらの酵素が、クエン酸回路でリンゴ酸を変換しているかを調べました。MEのリンゴ酸への反応効率は、MDHの反応効率の約14倍でした。MEをもたないラン藻の変異株は、MDHをもたない変異株と異なり、細胞内に過剰にリンゴ酸を蓄積しました。ラン藻の中で、MEをもつ種は、MDHをもつ種よりも多いことが分かりました。以上の結果から、ラン藻のクエン酸回路では、MEによって、リンゴ酸が“ピルビン酸”に変換されることが示されました。
本研究の結果は、これまで生物全体で“決まっている”と考えられてきたクエン酸回路の酵素反応が、生物ごとに異なることを示唆しています。今後は、本研究で行ったような解析を他の生物でも行い、クエン酸回路の酵素反応を生物ごとに特定する必要があります。
本研究は、明治大学大学院農学研究科 伊東 昇紀助教、片山 徳賢(博士後期課程2年)、小山内 崇准教授らのグループによって行われました。JST戦略的創造研究推進事業先端的低炭素化技術開発ALCA(代表小山内 崇)の援助により行われました。
本研究成果は、2022年10月31日発行の米国微生物学会の国際誌『
mBio』に掲載されました。
※研究グループ
明治大学 明治大学大学院農学研究科
環境バイオテクノロジー研究室
助教 伊東 昇紀(いとう しょうき)
博士後期課程2年生 片山 徳賢(かたやま のりあき)
准教授 小山内 崇(おさない たかし)
研究技術員 岩住 香織(いわずみ かおり)
生物物理学研究室
准教授 鈴木 博実(すずき ひろみ)
1.背景
ラン藻(別名:シアノバクテリア)は、植物と同じ酸素発生型の光合成を行うバクテリアの総称です。ラン藻は、糖を炭素源として生育する大腸菌や乳酸菌などの他のバクテリアと異なり、光合成によって取り込んだ二酸化炭素を唯一の炭素源として生育することができます。地球温暖化などの環境問題や化石燃料の使用が世界的な問題となっている昨今では、ラン藻を利用して、二酸化炭素からプラスチックや燃料をつくる物質生産が注目を集めています。ラン藻は、形状や生育する環境が異なる多様な種が存在しており、全遺伝情報が分かっている種だけでも100種以上が存在しています。そのラン藻の中でも、初めて全遺伝情報が解明された種が、シネコシスティス
注1)という種です。シネコシスティスは、球形の1つの細胞からなるラン藻で(図1)、淡水に生息しています。シネコシスティスは、人為的な遺伝子改変や凍結保存が容易に行えるといった実験生物として多くの利点をもっているため、ラン藻のモデル種として、様々な研究に利用されています。
クエン酸回路は、生物がもつ最も重要な代謝経路の1つです。クエン酸回路は、8つの酵素反応によって構成されており、それらの反応を担う酵素は、バクテリアからヒトまで広く保存されています。通常、クエン酸回路は、酵素反応によって代謝産物を酸化していく過程で、NADHというエネルギーをもつ物質を沢山生成します。そのため、クエン酸回路は、細胞内でのエネルギー生成において中心的な役割を担っています。ラン藻も、このクエン酸回路をもっていますが、ラン藻のクエン酸回路では、NADHに加えて、NADPHという別のエネルギー物質も生成されるという点で、他の生物と異なっています。また、コハク酸やフマル酸といったクエン酸回路の代謝産物は、食品添加物やバイオプラスチックの原料としての用途がある有用物質です。そのため、近年では、ラン藻のクエン酸回路を利用した様々な有用物質の生産が盛んに検討されています。特に、シネコシスティスにおいて物質生産の研究が進められており、これまで4種類の有用物質の生産が報告されています。このように、ラン藻において、クエン酸回路は、生命活動と物質生産の両方で重要な代謝経路となっています。
リンゴ酸は、クエン酸回路の代謝産物の1つです。一般的に、クエン酸回路の中で、リンゴ酸は、リンゴ酸脱水素酵素(MDH)という酵素の働きによって、オキサロ酢酸に変換されます(図1)。しかしながら、以前の研究によって、シネコシスティスのMDHは、リンゴ酸に対する活性が他の生物のMDHと比べて低く、逆反応に特異的に活性を示すことがわかりました。また、MDHの反応は、NADHの生成を伴う反応ですが、エネルギー物質の生成を伴う他のシネコシスティスのクエン酸回路の反応は、NADPHの生成反応となっています。要するに、MDHの反応は、ラン藻のクエン酸回路の反応の中で仲間外れでした。そのため、ラン藻では、MDHがクエン酸回路でリンゴ酸を変換しているか不明瞭であり、リンゴ酸を変換する酵素はまだ決定づけられていませんでした。
ラン藻は、リンゴ酸を変換する他の酵素として、マリックエンザイム(ME)という酵素をもっています。MEは、リンゴ酸をオキサロ酢酸ではなく、ピルビン酸に変換する酵素です(図1)。MEの役割は生物によって様々で、哺乳動物では脂肪酸の合成に寄与し、トウモロコシなどの植物では光合成に関わる反応として機能することがわかっています。このMEをラン藻ももっていることは、20年以上前から分かっていましたが、ラン藻のMEの性質や細胞内での働きを調べるような研究は行われていませんでした。
2.研究手法と成果
今回、本研究グループは、MEとMDHに着目した3種類の解析を行い、MDHではなく、MEが、ラン藻のクエン酸回路でリンゴ酸を変換することを明らかにしました。
はじめに、シネコシスティスのMEとMDHを精製し、シネコシスティスの細胞内を模倣した条件下で、その性質を比較しました。その結果、MEは、MDHよりも約14倍高い反応効率を示すことがわかりました(図2)。また、MEの反応は、MDHの反応(NADHの生成を伴う反応)と異なり、他のクエン酸回路の反応同様、NADPHの生成を伴う反応でした。
次に、MEとMDHそれぞれをもたないシネコシスティスの変異株を作製して、細胞内にどれくらいリンゴ酸が蓄積しているかを調べました。その結果、MEをもたない変異株は、変異をいれていない通常の株と比べて、約3倍のリンゴ酸を蓄積しました(図3)。リンゴ酸は、MEの基質であるため、変異株におけるリンゴ酸の蓄積は、MEが細胞内でリンゴ酸を変換していることを意味しています。一方で、MDHをもたない変異株のリンゴ酸量は、通常の株と同程度でした(図3)。
最後に、MEとMDHをもっている種がラン藻の中でどれくらい存在するかを、ラン藻の遺伝情報をパソコン上で解析することで調べました。その結果、全遺伝情報が分かっている130種のラン藻のうち、MEをもっている種が102種(78%)であるのに対し、MDHをもっている種が66種(51%)であることがわかりました(図4)。また、MEだけを持っている種が存在するのに対し、MDHだけを持っている種が存在しないこともわかりました(図4)。
以上の結果から、ラン藻では、MDHではなく、MEが、主にクエン酸回路でリンゴ酸を変換することが示されました(図5)。ラン藻のクエン酸回路では、リンゴ酸が、オキサロ酢酸ではなく“ピルビン酸”に変換されます(図5)。また、このMEを利用するクエン酸回路は、一般的なクエン酸回路と異なり、NADHではなく、NADPHを生成する経路となっています(図5)。
3.今後の期待
本研究グループは、ラン藻のクエン酸回路の酵素反応の一部が、一般的なクエン酸回路と異なることを明らかにしました。さらに、ラン藻のクエン酸回路から生成されるエネルギー物質がNADPHであることを明らかにしました。この成果は、ラン藻のクエン酸回路から生成する有用物質の増産につながる新たなアプローチを浮き彫りにすると期待されます。また、本研究の結果は、これまで生物全体で広く保存されていると考えられてきたクエン酸回路の酵素(酵素反応)に多様性があることを示唆しています。そのため、今後は、ラン藻以外の生物に対しても、本研究で行ったような解析を実行し、クエン酸回路に関わる酵素反応を各生物で明らかにする必要があると思われます。
4.論文情報
<タイトル>
Malic enzyme, not malate dehydrogenase, mainly oxidizes malate that originates from the tricarboxylic acid cycle in cyanobacteria
(日本語タイトル リンゴ酸脱水素酵素ではなくマリックエンザイムが、主にラン藻のクエン酸回路に由来するリンゴ酸を酸化する)
<著者名>
Noriaki Katayama, Kaori Iwazumi, Hiromi Suzuki, Takashi Osanai, Shoki Ito
<雑誌>
mBio
<DOI>
5.補足説明
最もよく研究されている単細胞性のラン藻。淡水性で、窒素固定を行わない。直径1.5-2.0マイクロメートルほどで、球形をしている。1996年に、ラン藻としては初めて全ゲノム配列が決定された。増殖が速く、遺伝子改変が容易で、凍結保存が可能であるなどの利点を有する。そのため、モデルラン藻として、ラン藻の基礎研究・応用研究の両分野で広く利用されている。学名は、Synechocystis sp. PCC 6803である。